环腺苷酸（cAMP）ELISA 检测试剂盒

货号: BK101

批号: 11A601

背景介绍

cAMP 和 cGMP 都是小分子的环状核苷酸，以微量存在于动植物细胞和微生物中，被称其为细胞内的第二信使（激SU为fist信使）。

cAMP（或 cGMP）由腺苷酸（或鸟苷酸）环化酶产生，被磷S二酯酶降解，因此激火腺苷酸（或鸟苷酸）环化酶或者抑制磷S二酯酶，可以提高细胞内 cAMP（或 cGMP）的含量。研究发现，cAMP（或 cGMP）特异性磷S二酯酶的抑制剂可用于人类疾病的治L。如：

增强 β 肾shang腺素能受体（cAMP 的封闭剂）已被用于心率失调、高血压、心肌梗死等心脏疾病；cAMP 特异性磷S二酯酶2/4的抑制剂正在进行认知增强方面的临床测试；而 cGMP 特异性磷S二酯酶类型5可用于治Liao ED 等疾病。在五十年的研究历程中，从开始研究 cAMP，cGMP 在各种生理过程中的调节作用，到近几年与之相关的药物研发，药物筛选领域，人们一直在努力寻找一种快速、灵敏、特异性和可重复地定量检测 cAMP 和 cGMP 含量的方法。cAMP，cGMP 分子量分别只有329.21和345.21，在机体内的含量极低，为 pmol/L 级别，用一般的分析方法无法测定。70年代一系列测定 cAMP 和 cGMP 的方法被发明出来，基本的原理有三种：分别是竞争性蛋白质结合分析法、放射性免Y分析法和薄层色谱法。

所需材料

酶标仪（检测波长450 nm，参比波长630nm）

加样Q

EP 管

孔板振荡器

吸水纸

去离子水

样本处理

1. 组织样本：新鲜收集的组织样本必须立即冻存在液氮中。使用前去除冰冻样本

称重，加入 5-10 倍体积的 0.1M HCl。用匀浆器在冰上匀浆。然后室温离心 5min（＞600 g）。留上清，可以直接实验，或用 0.1M HCl 稀释。

2. 细胞样本：去除培养基，加入适量 0.1M HCl（在 0.1M HCl 中加入 0.1%~1%Triton X-100 可增强细胞的溶解效果），放置 10min，期间观察以确认细胞是否发生溶解。如果溶解不充分，可以再增加 10min，直至细胞完全溶解。室温离心 5min（600 g）。留上清，

用于本试剂盒检测。注：上述浓度的 Triton X-100 不会影响样品与板的结合，但可能会增加

背景值，建议用含相同浓度 Triton X-100 稀释标准品，以去除误差。

3. 尿液、血浆和培养液：每 ml 样品中加入 10?l 浓HCL（12M），混匀后，室温离心

5min（600 g），留上清，用于本试剂盒检测。血浆、血清、全血和组织匀浆通常含有磷S二

酯酶（phosphodiesterases）和大量免Y球蛋白（Ig），它们会干扰实验。用 0.1 M HCl 处理样

品，可以灭活磷S二酯酶和降低免Y球蛋白的浓度，使之可以用于本试剂盒。磷S二酯酶和

免Y球蛋白也可以通过加入 2% TCA（三LV乙suan）使之沉淀或用截留分子量 10 KD 的超滤离

心管去除。

注意事项

1. 本试剂盒所有相关试剂均预先平衡至室温（20-25℃）。

2. 各孔分别加入标准品和样品。

3. 沿孔壁加入各试剂，避免交叉污染。

4. 本试剂盒提供的是可分拆的孔板条，使用者可以按照样品数量选择使用量。未

用的孔板请放回原封口袋，保存在 4℃。孔板请放在本试剂盒配送的孔板架上

使用。

5. 加入底物前，请确保孔中没有残余液体。

6. 终止液具有腐蚀性，请小心使用。

试剂准备

1. cAMP 标准品溶液

取 8 个新 EP 管，分别标记 1-8#。在 1#管中加入 980 μl 0.1M HCl，2-8#管中分别加 500

μl 0.1M HCl。加入 20μl 标准品（10000 pmol/mL）到 1#管中，剧烈振荡。从 1#管中取

去 500μl 加入 2#管，剧烈振荡。同样方法完成 3-8#管的稀释（1-8#管 cAMP 浓度分别

是 200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56pmol/ml）。稀释好的标准品建议在 15min

内使用。另外，标记一个新 EP 管为 B0（maximum binding，0pmol/ml），加入 500μl 0.1M

HCl。

2.

“Assay Buffer 工作液”的准备

将本试剂盒的 Assay Buffer（10×）（30 ml） 加入 270 ml 去离子水中。

注：配好的 Assay Buffer 工作液可室温保存 3 个月（但不能超出试剂盒的保质期）

3.

“cAMP-HRP Conjugate 工作液”的准备

用配好的 Assay Buffer 按 1:1000 将 cAMP-HRP Conjugate（1000×）稀释至工作液。.

实验步骤

注：所有标准品管包括 B0 管以及样品管均要加入相同体积的 Neutralizing Buffer，并立即振荡 2sec.

1. 每个孔中加入 50 ?l Neutralizing Buffer。TA （Total Activity）和空白孔除外。

2. 加 50 ?l 0.1M HCl 至 NSB 孔（Non-Specific Binding）和 B0 孔。

3. 分别取 50 ?l 各浓度标准品溶液至相应孔中。.

4. 取 50 ?l 样品溶液至相应孔中。

5. 各取 50 ?l Assay Buffer 工作液至 NSB 孔中。

6. 取 50 ?l cAMP-HRP Conjugate 工作液至各孔中（TA 和空白孔不加）。

7. 取 50 ?l Anti-cAMP monoclonal antibody 至各孔中（TA、空白和 NSB 孔不加）。

8. 室温孵育 2 hrs。

9. 倒空，用 Assay Buffer 工作液洗 4 遍，每次倒干净残余液体。

10. 加入 5 ?l cAMP-HRP Conjugate 工作液至 TA 孔中。

11. 取 150 ?l TMB Substrate 至各孔中，室温静置 10min 左右。

12. 加 50 ?l Stop Solution 至各孔中，并立即上酶标仪读数（检测波长为 450nm，参比波长

为 630nm）。扣除每个读数的 Blank（空白）孔光密度值

Blank: only contains substrate.

TA: Total activity, contains cAMP-HRP conjugate (5?l) and substrate.

NSB: Non-specific binding, contains neutralizing buffer, cAMP-HRP conjugate and substrate.

B0: 0 pg/mL standard, contains neutralizing buffer, cAMP-HRP conjugate, Anti-cAMP

monoclonal antibody and substrate.

S1-S8: Standards 1-8

SP1-SP72: samples

结果计算

1. 样品和标准品的净 OD 平均值的计算：

净 OD 平均值=OD 平均值-NSB 孔 OD 平均值

2. 结合率（各浓度标准品的结合率占较大结合率（B0 孔）的百分比）计算：

结合率（B/B0）=（净 OD 平均值/B0 孔 OD 平均值）×100

3. 用软件（如 Curve Expert 或 ELISA Calc）进行结合率（或净 OD 平均值）对 Log（cGMP

标准品浓度）的三次多项式回归曲线拟合（three order polynomial linear regression curve）

或指数 Logistic 曲线拟合。

4. 通过样品的结合率即可计算出样品中 cAMP 浓度。